乙型肝炎病毒耐药基因检测概述20190912
2019-09-12 16:30
一、乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义
WHO相关资料显示，全球感染过乙型肝炎病毒（HBV）的患者超过三分之一，而慢性乙型肝炎患者约有2.4亿，乙肝严重影响着人类的生命健康。HBV是传染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化甚至肝细胞癌变。HBV属嗜肝DNA病毒科，为双链DNA病毒，容易发生变异，从而形成不同的基因型。目前已根据HBV核苷酸序列异质性≥8%将其分成A-J 10种基因型[1-2]。在我国北方以C型为主，南方以B型为主，新疆有出现D型。作为常规抗病毒治疗的核苷（酸）类似药物，拉米夫定(LAM)和阿德福韦酯(ADV)等能够有效抑制HBV的复制，然而长期使用会导致耐药的发生，使治疗效果明显下降。随着分子生物学的快速发展，越来越多的分子生物学技术用于HBV的基因分析，从而为乙肝患者的抗病毒治疗提供科学的依据。尽早检测HBV变异，准确判断拉米夫定和阿德福韦酯等治疗后耐药，指导个性化用药，对于提高乙肝治疗成功率具有很重要的价值。
二、乙型肝炎病毒耐药机制以及常见的突变基因位点
HBV基因型耐药是指乙肝病毒出现某种特定的突变，这些特定的突变点导致HBV耐药。其分子机制是：HBV是一种变异较高的病毒，在复制过程必须经过RNA中间体的逆转录复制步骤，但RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，因此在宿主免疫压力和抗病毒药物的选择压力下，其核酸在少数位点上发生突变是一种常见现象。
HBV对核苷（酸）类似物耐药的产生与HBV聚合酶基因变异有关，并且HBV聚合酶基因变异是多位点的，以C区YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）基序的变异最为重要。拉米夫定(LAM)的主要耐药位点位于C区（rtM204V/I），204位点的蛋氨酸被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）置换，即rtM204V/I。上述突变直接导致病毒对药物的敏感性降低，被称为原发耐药突变。另外部分突变不直接引起病毒对药物敏感性的下降，但可以恢复原发耐药变异病毒受损的复制力，被称为补偿耐药突变，主要有rtV173L、rtL180M(常与rtM204V共同出现)和rtL80I(常与rtM204I共同出现)[3]。比如，HBV双点突变株如rtM204V/rtL180M，其病毒复制能力强于rtM204I的单点突变株，可能与rtL180M（B区）的变异补偿C区YMDD变异株的复制缺陷有关。而另一种代表药物阿德福韦酯(ADV)，其耐药变异位点则主要集中于HBV聚合酶基因B区rtA181T和D区rtN236T位点。
三、乙型肝炎病毒耐药基因检测方法[4-6]
1.PCR产物直接测序：是将HBV基因组的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序分析的方法。PCR产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点，是最常用的基因型耐药检测方法之一。PCR产物直接测序的方法一般作为基因型耐药检测的金标准。该方法的缺点是灵敏性较差，只有当变异株超过HBV准种池的20%时才能被发现。
2.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)：该方法具有较强的灵敏性，可检测数量占HBV准种池5%的耐药变异株。但是PCR-RFLP只能检测已知、单一位点的变异，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。但随着多种核苷（酸）类似物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难以胜任多位点变异的检测。
3.反向杂交法：基于该技术的INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测，目前INNO-LiPA HBV DR v3 可检测包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)与阿德福韦酯(ADV)常见耐药位点。该法可检测变异株占HBV准种池5% ~ 10%的样品，故敏感性较好，但其同样只能检测已知位点变异。
4.实时荧光PCR：该方法操作简便，可检测变异发生率低于10%的耐药变异。仅能检测已知位点。
5.基因芯片：亦称DNA芯片、DNA微阵列，可检测已知变异位点。
6.限制性片段质谱多态性技术：该技术是将PCR-RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合，灵敏度高，能够发现数量不足HBV准种池1%的变异株，但其同样仅能检测已知位点变异，且价格昂贵，很难在临床推广应用。
四、目前已上市产品介绍
我国已批准上市的乙型肝炎病毒耐药基因检测试剂盒较多采用荧光PCR法，主要为国产产品，针对的基因突变位点主要是204位点的YMDD→YIDD（550ATG→ATT及550ATG→ATC）与YMDD→YVDD（550ATG→GTG）。还有较少产品能够检测发生在180位点（rtL180M）的基因突变。
五、小结
由于肝细胞中的共价环状闭合DNA持续存在，使得乙肝患者需要长期用药治疗。抗HBV核苷（酸）类药物主要有拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV)和富马酸替诺福韦酯(TDF)，其中前4种已在我国上市。长期使用核苷（酸）类似药物不可避免地导致耐药基因突变，最终病毒恢复复制能力，病情反弹。尽早进行乙肝病毒耐药基因突变的检测，可以及时发现病毒的耐药情况，指导医生合理用药。随着生物检测技术的发展，越来越多的突变位点被发现，为此类产品的技术审评带来挑战。
参考文献：
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[3] 徐东平. 乙肝病毒耐药的检测方法与临床意义[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(6): 611-613.
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陈慧毅 王嘉欣 何静云 供稿
（原创 2019-09-12 CMDE 中国器审）
